Экстракция

This content was provided by Hielscher Ultrasonics GmbH

Разрушение клеточных структур (лизис) посредством ультразвука применяется для извлечения межклеточных соединений в целях микробной инактивации.

Предпосылка

В микробиологии ультразвук в первую очередь ассоциируется с разрушением клеточных структур (лизисом) или с распадом клетки. При высокоинтенсивной обработке ультразвуком жидкостей звуковые волны, которые распространяются в жидкой среде, приводят к чередованию циклов высокого давления (компрессия) и низкого давления (разряжение), причём их скорости зависят от частоты. Во время цикла низкого давления высокоинтенсивные ультразвуковые волны создают мелкие пузырьки вакуума, или пустоты в жидкости. Когда пузырьки достигают объёма, при котором они больше не могут поглощать энергию, они с силой лопаются во время цикла высокого давления. Данное явление носит название кавитации. Во время лопания местами достигаются очень высокие температуры (около 5000 K) и давление (около 2,000 атм.). Лопанье кавитационного пузырька также приводит к возникновению струй жидкости, обладающих скоростью до 280 м/сек. Возникшие силы сдвига механически разрушают оболочку ячейки и улучшают перенос материала. Ультразвук может иметь либо деструктивное, либо конструктивное воздействие на клетки в зависимости от использованных параметров ультразвуковой обработки.

Разрушение клетки

При интенсивной ультразвуковой обработке ферменты или белки могут быть выделены из клеток либо из внутриклеточных органоидов в результате разрушения клеточных структур. В этом случае соединение, подлежащее растворению в растворителе, заключается в нерастворимую структуру. Для того, чтобы его извлечь, следует разрушить мембрану клетки. Разрушение клетки – это сложный процесс из-за способности стенок клетки выдерживать внутреннее высокое осмотическое давление. Требуется хороший контроль над разрушением клетки, чтобы избежать беспрепятственного выделения всех внутриклеточных продуктов, включая клеточный детрит и нуклеиновые кислоты либо продукты денатурации. Обработка ультразвуком служит в качестве хорошо контролируемого средства разрушения клетки. При этом механические эффекты ультразвука обеспечивают более быстрое и более полное проникновение растворителя внутрь материалов клетки и улучшают перенос массы. Ультразвук обеспечивает большее проникновение растворителя в растительную ткань и улучшает массоперенос. Ультразвуковые волны, генерирующие кавитацию, разрушают стенки клетки и облегчают выделение матричных компонентов.

Массоперенос

В целом, ультразвук может привести к проницаемости клеточных мембран до ионов, и он может значительно снизить избирательность клеточных мембран. Механическая активность ультразвука поддерживает диффузию растворителей в ткани. Поскольку ультразвук механически разрушает стенку клетки кавитационными силами сдвига, он облегчает перенос массы из клетки в растворитель. Уменьшение размера частиц посредством ультразвуковой кавитации увеличивает площадь поверхности контакта твёрдой и жидкой фаз.

Извлечение белка и фермента

В частности, извлечение белков и ферментов, хранящихся в клетках и внутриклеточных частицах, является уникальным и эффективным применением высокоинтенсивного ультразвука, так как извлечение органических соединений, содержащихся в теле растений и в семенах, с помощью растворителя может быть улучшено. Поэтому, ультразвук имеет потенциальное преимущество в извлечении и отделении исходных, потенциально биоактивных компонентов, например, из потоков неиспользуемых сопутствующих продуктов, образовавшихся в ходе текущих процессов. Ультразвук также может помочь в интенсификации эффектов обработки ферментов, тем самым, снижая количество необходимых ферментов или увеличивая выход извлекаемых важных соединений.

Липиды и белки

Ультразвуковая обработка часто используется для улучшения извлечения липидов и белков из семян растений, таких как соевые бобы (например, мука или обезжиренные соевые бобы) или прочих масличных семян. В этом случае разрушение стенок клеток облегчает (холодное или горячее) прессование, снижая, тем самым, количество остаточного масла или жира в отжиме. Влияние непрерывного ультразвукового извлечения рассеянного белка было продемонстрировано Moulton и др. Ультразвуковая обработка постепенно увеличивала извлечение рассеянного протеина по мере того, как соотношение хлопья/растворитель менялось с 1:10 до 1:30. Она показала, что ультразвук способен пептизировать белки сои при практически любом коммерческом выходе и что величина ультразвуковой энергии, требуемая для этого, была самой низкой, когда использовались более сгущённые осадки.

Применяется для извлечения цитрусового масла из фруктов, масла из горчичного порошка, арахиса, рапса, масла из травянистого сырья, канолы, сои, кукурузы.

Высвобождение фенольных соединений и антоцианинов

Ферменты, такие как пектиназы, целлюлазы и гемицеллюлазы, широко используются в получении соков для того, чтобы разрушить стенки клеток и улучшить экстрагируемость соков. Разрушение матрицы стенок клетки также выпускает в соки такие компоненты, как фенольные соединения. Ультразвук улучшает процесс извлечения, что приводит к увеличению выхода фенольных соединений, алкалоидов и сока, обычно остающихся в отжиме.

Благоприятные воздействия ультразвуковой обработки на выделение фенольных соединений и антоцианинов из виноградной и ягодной матрицы, в частности, из черники (Vaccinium myrtillus) и черной смородины (Ribes nigrum) в сок, изучалось компанией VTT Biotechnology, Финляндия (проект Европейского Союза MAXFUN) с применением ультразвукового процессора UIP2000 после размораживания, раздавливания и инкубации ферментов. Разрушение стенок клеток ферментной обработкой (Pectinex BE-3L для черники и Biopectinase CCM для чёрной смородины) оказывалось лучше, когда её совмещали с ультразвуковым усилением. "Ультразвуковая обработка увеличивает концентрацию фенольных соединений в черничном соке более, чем на 15% [...] Влияние ультразвука было более значительным на черную смородину, которая является более проблемной ягодой с точке зрения её переработки на сок, чем черника в связи с высоким содержанием пектина в ней и в связи с разной конфигурацией стенок клеток у неё. [...] Концентрация фенольных соединений в соке возросла на 15-25% при использовании ультразвуковой обработки после ферментной инкубации." (Mokkila и др. 2004)

Микробная и ферментная инактивация

Микробная и ферментная инактивация (консервирование), например, фруктовые соки и соусы, является другой сферой применения ультразвука в пищевой промышленности. Сегодня консервирование путём резкого повышения температуры на короткий период времени (пастеризация) остаётся наиболее популярным методом микробной или ферментной инактивации, которая ведёт к более длительному сроку хранения (консервации). В связи с воздействием высоких температур данный термический метод часто плохо подходит для многих пищевых продуктов. Получение новых веществ в результате реакций с тепловым катализатором и изменение макромолекул, а также деформация животных и растительных структур могут привести к потере в качестве. Поэтому, термообработка может вызвать нежелательные изменения сенсорных признаков - текстуры, вкуса, цвета, запаха и пищевых качеств, т.е. витаминов и белков. Ультразвук является эффективной нетермической (минимально термической) альтернативой.

Тепло, генерированное кавитацией по месту, и созданные радикалы могут привести к инактивации ферментов ультразвуком. При достаточно низких уровнях ультразвуковой обработки структурные и метаболические изменения могут произойти в клетках без их разрушения. Активность пероксидаза, присутствующего в большинстве сырых и небланшированных фруктах и овощах, которая может быть частично связана с развитием безвкусных и окрашивающих в коричневый цвет пигментов, можно значительно снизить, применяя ультразвук. Термоустойчивые ферменты, такие как липаза и протеаза, которые выдерживают сверхвысокую температуру и которые могут снизить качество хранящегося пастеризованного молока и других молочных продуктов, могут быть более эффективно инактивированы одновременным применением ультразвука, тепла и давления.

Ультразвук продемонстрировал свой потенциал в разрушении пищевых патогенов, а именно, E.coli, Salmonellae, Ascaris, Giargia, Cryptosporidium cysts, и Poliovirus.

Применяется для хранения джемов, мармелада, мороженого, фруктовых соков, соусов, мясных и молочных продуктов. Взаимодействие ультразвука с температурой и давлением

Ультразвуковая обработка часто оказывается более эффективной, когда она применяется в сочетании с другими противомикробными методами, например:

• Сочетание термообработки с ультразвуковой обработкой
• Сочетание ультразвуковой обработки с обработкой давлением
• Сочетание ультразвуковой обработки с обработкой давлением и с термообработкой

Такое применение ультразвука в сочетании с термообработкой и обработкой давлением рекомендуется для Bacillus subtilis, Bacillus coagulans, Bacillus cereus, Bacillus sterothermophilus, Saccharomyces cerevisiae, и Aeromonas hydrophila.

Разработка процесса

В отличие от нетермических процессов, таких как высокое гидростатическое давление (HP), сжатая двуокись углерода (cCO2) и сверхкритическая двуокись углерода (ScCO2), а также высокие импульсы электрических полей (HELP), ультразвуковой метод можно легко проверить в лабораторном или настольном масштабе – получая воспроизводимые результаты для увеличения масштаба. Характеристики интенсивности и кавитации могут быть легко адаптированы под конкретный процесс извлечения для выполнения конкретно поставленных целей. Амплитуда и давление могут варьироваться в широком диапазоне, например, для выявления энергетически наиболее эффективной формы извлечения. Тем не менее, ткани должны подвергаться вымачиванию, измельчению или распылению перед обработкой ультразвуком.

E.coli

Для получения небольших количеств рекомбинантных белков в целях их изучения и определения характеристик их биологических свойств самым лучшим выбором является бактерия E.coli. Метки очистки, например, полигистидиновый хвост, бета-галактозидаза или белки, связывающие мальтозу, обычно присоединяются к рекомбинантным белкам для того, чтобы сделать их отделяемыми от клеточных экстрактов с чистотой, удовлетворяющей большинству аналитических задач.

Ультразвуковая обработка позволяет максимизировать выход белков, в частности, когда выход продукции низок, и сохранить структуру и активность рекомбинантного белка.

Разрушение клеток E.coli для извлечения общего белка, извлечение химозина, было исследовано Kim и Zayas.

Извлечение шафрана

Шафран известен как самая дорогая специя на мировом рынке, и он отличается своим нежным ароматом, горьким привкусом и привлекательным жёлтым цветом. Шафрановая специя получается из красного рыльца цветка шафранового крокуса. После сушки эти части используются в качестве приправы на кухне или в качестве красителя. Интенсивный характерный аромат шафрана является результатом смешения трёх компонентов: кроцинов, пикрокроцина и сафраналя.

Kadkhodaee и Hemmati-Kakhki показали в своём исследовании, что обработка ультразвуком значительно увеличила извлечение шафрана и снизила время на обработку. Действительно, результаты, полученные ультразвуковым извлечением, были гораздо лучше заметны, чем результаты традиционного извлечения при помощи холодной воды, что предлагается стандартом ISO. Для своих исследований Kadkhodaee и Hemmati-Kakhki использовали ультразвуковое устройство UP50H фирмы Hielscher. Наилучшие результаты были достигнуты с помощью импульсной ультразвуковой обработки. Это означает, что кратковременные импульсы были более эффективными, чем непрерывная ультразвуковая обработка.

Окисление

При контролируемой интенсивности применение ультразвука для биотрансформации и ферментации может способствовать улучшению биологической обработки, благодаря индуцированным биологическим эффектам и облегчению клеточного массопереноса. Влияние контролируемого применения ультразвука (20 кГц) на окисление холестерина в холестенон оставшимися клетками Rhodococcus erythropolis ATCC 25544 (раньше Nocardia erythropolis) исследовалось Баром.

Cholesterol + O₂ = cholest-4-en-3-one + H₂O₂

Данная система является типичной микробной трансформацией стеринов и стероидов, в которых субстрат и продукты являются твёрдыми веществами, нерастворимыми в воде. Поэтому, данная система скорее уникальна тем, что как клетки, так и твёрдые вещества могут подвергнуться воздействию ультразвука. При достаточно низкой ультразвуковой интенсивности, которая сохраняла структурную целостность клеток и поддерживала их метаболическую активность, Бар наблюдал значительное увеличение кинетических скоростей биотрансформации в микробных суспензиях холестерина (1.0 и 2.5 г/л) во время их обработки ультразвуком выходной мощностью 0.2 вт/см² в течение 5 секунд каждые 10 минут. Ультразвук показал отсутствие какого-либо воздействия на ферментное окисление холестерина (2.5 г/л) его оксидазой.

Перспективная технология

Использование ультразвуковой кавитации для извлечения и хранения пищевых продуктов является новой мощной производственной технологией, которая не только может применяться без какого-либо риска и быть экологически безопасной, но и быть эффективной и экономичной. Гомогенизирующий и защитный эффект может легко применяться для фруктовых соков и пюре (например, апельсин, яблоко, грейпфрут, манго, виноград, слива), а также для овощных соусов и супов, например, томатный соус или суп из спаржи.

Устройство	Порционный объем, мл	Расход, мл/мин
UP50H	0.01 - 250
UP200St	0,1 - 1000	20 - 200
UIP2000hd	100 – 20000	200 - 4000